克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体特异性抗体分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
一 克隆化方案
用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
1. 有限稀释法的程序
① 制备饲养细胞悬液同融合前准备
② 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml
③ 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
④ 培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。
⑤ 第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。
注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
2. 软琼脂法
① 软琼脂的配制
含20％FCS小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640
1％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。
0.5％琼脂：由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
② 用上述0.5％琼脂液含有饲养细胞15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
④ 1ml 0.5％琼脂液42℃预热在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
⑤ 混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。
⑥ 4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
⑦ 检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。
二 杂交瘤细胞的冻存
及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。
杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。
细胞冻存液:
50％小牛血清
40％不完全培养液
10％ DMSO二甲亚砜
冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃ 后放-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
五、单克隆抗体的大量生产
大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：
1. 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。
2. 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。
① 实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml, 共2～4点。待肿瘤达到一定大小后一般10～20天则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg／ml。但采血量有限。
② 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mlPristane降植烷或液体石腊于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml， 这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。
